常用于工業(yè)的三聚氰胺經(jīng)常與甲醛混合制成一種因阻燃性能而廣為人知的塑料——三聚氰胺－甲醛樹脂。除了用于制造工作臺面、寫字板、層壓板、粘膠劑、黏合劑、紙張以及織物以外，近來在一些食品中也發(fā)現(xiàn)了三聚氰胺的蹤跡。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，一些原材料供應(yīng)商非法地將這種富含氮元素的化學(xué)物質(zhì)添加至食品源中，制造蛋白質(zhì)含量增加的假象。 

一些奶農(nóng)將牛奶稀釋以增加利潤，尤其是在技術(shù)發(fā)展緩慢、牛奶生產(chǎn)的利潤率并未隨效率的提高而增加的地方。這種稀釋行為使得牛奶質(zhì)量下降，蛋白質(zhì)、脂肪以及糖的濃度顯著降低。一些奶農(nóng)稀釋牛奶的程度高達(dá)30%，隨后使用三聚氰胺掩飾這種欺詐行為。質(zhì)量控制設(shè)備檢測的是正常水平的氮元素（蛋白質(zhì)含有的），三聚氰胺中高含量的氮能夠在檢測中蒙混過關(guān)，讓造假的牛奶作為優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品通過檢測，從而顯著地增加利潤。 

三聚氰胺與三聚氰酸結(jié)合后（通常見于三聚氰胺廢渣中的一種雜質(zhì)）在體內(nèi)聚集，形成不溶晶體，產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性。氰尿酸三聚氰胺吸收進(jìn)入血液，在腎臟微管的尿液中聚集并發(fā)生作用。隨后結(jié)晶，形成大量球形黃色晶體，堵塞并損傷微管中的腎臟細(xì)胞，導(dǎo)致嚴(yán)重的腎功能障礙。接觸時間延長則會導(dǎo)致其他健康問題，例如生殖損傷、膀胱或腎結(jié)石、以及癌癥。食品中蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法是凱氏定氮法以及杜馬斯燃燒法，兩種方法測定的都是氮的含量。這些方法不能將三聚氰胺的氮與氨基酸中天然存在的氮元素區(qū)分開來。已經(jīng)有高靈敏度的方法用于檢測三聚氰胺，而不是測定氮元素。液相色譜（LC）可以單獨使用，或是與串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合使用（LC/MS/MS），還可以將氣相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合使用（GC/MS/MS）。 

這些色譜方法非常精確，但對于設(shè)備和操作而言，準(zhǔn)備及運行的成本都非常高。因此迫切需要一個簡單的高通量篩選方法，以合理的成本精確檢測牛奶中三聚氰胺的殘留量。 

經(jīng)典的ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定）測量可以作為一個理想的解決方案。這種方法可以在微孔板中進(jìn)行，因此樣品數(shù)量較多時可以同時進(jìn)行，儀器成本也不高。已經(jīng)開發(fā)了免疫測定試劑盒，可以高效、簡便、靈敏地檢測乳制品、動物飼料以及寵物食品的原料中的三聚氰胺污染物。 

本文是關(guān)于如何使用簡便的ELISAs ，高靈敏地篩選牛奶樣品中的三聚氰胺。這些檢測需要具備足夠的靈敏度，檢出10礸以下的三聚氰胺，這是全世界的監(jiān)管機構(gòu)對非嬰兒類食品設(shè)定的界限。

檢測原理 

本研究中，使用了兩種來自不同生產(chǎn)商、但是基本原理相同的三聚氰胺ELISA商品試劑盒。未知樣品以及辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的三聚氰胺均置于三聚氰胺抗體包被的微孔板孔中。HRP標(biāo)記的三聚氰胺與未知樣品中的三聚氰胺競爭結(jié)合抗體。結(jié)合率相當(dāng)于HRP標(biāo)記物與游離三聚氰胺的濃度比。因此，與抗體結(jié)合的HRP標(biāo)記物的量與樣品中游離三聚氰胺的數(shù)量反向相關(guān)。 

結(jié)合階段之后，使用微孔板清洗機去除未結(jié)合的物質(zhì)，加入HRP顯色底物。測定的HRP酶活與HRP標(biāo)記的三聚氰胺的數(shù)量成正比，并且與未知樣品中三聚氰胺的濃度有關(guān)。規(guī)定的孵育時間之后中止反應(yīng)，測定形成的有色染料的量。如果樣品中不存在三聚氰胺，通過形成的有色染料的數(shù)量及較高吸收值可以得知酶活水平較高。未標(biāo)記的游離三聚氰胺的量增加，則活力水平和吸收值降低。因此根據(jù)校準(zhǔn)曲線（隨后討論）就可以直接測定三聚氰胺的濃度。 

樣品制備 

三個不同的牛奶樣品——天然的全脂牛奶、脫脂牛奶以及天然奶粉制成的人造奶——加入純的三聚氰胺。這三種不同的乳制品與三聚氰胺儲備液（濃度為2mg/mL的蒸餾水溶液）混合制成加標(biāo)樣品。三種牛奶均加入20及100礸/L的三聚氰胺，全脂和脫脂牛奶樣品另外再加入濃度為550及1,000礸/L的三聚氰胺。 

對于第一種檢測試劑盒，加標(biāo)牛奶樣品按試劑盒操作方法進(jìn)行制備： 

◆在潔凈試管中加入大約1mL加標(biāo)牛奶樣品； 
◆樣品在1,500 g、10 ℃下離心10分鐘； 
◆取脂肪層下部分200礚轉(zhuǎn)入潔凈試管中；并且牛奶乳清中加入800礚檢測稀釋液，仔細(xì)混合稀釋樣品。 

對于第二種試劑盒，根據(jù)生產(chǎn)商直接提供的信息，對樣品的制備方法稍加調(diào)整，以提高檢測靈敏度。如果根據(jù)原有的說明制備牛奶樣品，會發(fā)現(xiàn)三聚氰胺檢測靈敏度低于第一種方法，因為根據(jù)原有的說明檢測樣品被稀釋過量： 

◆潔凈試管中加入大約1mL加標(biāo)牛奶； 
◆樣品在1,500g、10 ℃下離心10分鐘，分成3層； 
◆取中層250礚，轉(zhuǎn)入潔凈試管中；并且 
◆取出液體以1:3的比例加入10%的甲醇/PBS溶液（20mM）。 

“經(jīng)典的ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定）測量可以作為一個理想的解決方案。這種方法可以在微孔板中進(jìn)行，因此樣品數(shù)量較多時可以同時進(jìn)行，儀器成本也不高。” 

兩種ELISA試劑盒的使用都參照生產(chǎn)商的說明。抗體包被的微孔中加入三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品或加標(biāo)樣的加入量為100或150礚（取決于試劑盒）。隨后每一個微孔中加入50礚 HRP——三聚氰胺標(biāo)記物，混勻微孔板并在室溫孵育30分鐘。蒸餾水沖洗去除未結(jié)合的樣品。300 礚蒸餾水重復(fù)沖洗4次。100礚 HRP——底物分裝入每一個微孔中，微孔板在室溫下再次孵育20或30分鐘（取決于試劑盒）。加入100礚終止液終止反應(yīng)，使用六種不同的酶標(biāo)儀在450nm測定吸收值。制作校準(zhǔn)曲線，用于確定未知濃度。（該曲線可以根據(jù)吸收值或是準(zhǔn)確值進(jìn)行計算，空白對照的吸收值被設(shè)定為100%。） 

校準(zhǔn)曲線及檢驗靈敏度 

利用第一種試劑盒制作的三聚氰胺校準(zhǔn)曲線，使用了六種不同型號的酶標(biāo)儀進(jìn)行測定。計算第二種試劑盒的校準(zhǔn)曲線時，只使用了兩種酶標(biāo)儀。以前的數(shù)據(jù)顯示檢測儀對結(jié)果沒有影響。該方法的檢測限（LOD），是使用標(biāo)準(zhǔn)IUPAC 3*SD方法，根據(jù)校準(zhǔn)數(shù)據(jù)以及空白對照樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行計算。 

這些方法所需的測量范圍，與所有酶標(biāo)儀具有良好準(zhǔn)確度的波長范圍一致。這些方法的檢測限在很大程度上取決于測光讀數(shù)儀的準(zhǔn)確度和精確度。因此，LOD值之間僅存在極小的不具備顯著性的差異。對于兩種試劑盒，低于10 礸/L的三聚氰胺濃度能夠輕易檢出。因此，ELISA方法檢測三聚氰胺的準(zhǔn)確度與LC/MS/MS相當(dāng)。 

三聚氰胺的測定 

三種不同的牛奶加入純的三聚氰胺，用兩種試劑盒進(jìn)行分析。采用一系列不同的光度計進(jìn)行測量。 

數(shù)據(jù)表明，兩種試劑盒測定的酶活非常接近，回收率差異小于10%。此外，兩種試劑盒都存在一個相同的趨勢，即三聚氰胺高濃度樣品的濃度測量值稍偏低；不過，這對這些方法的使用不會產(chǎn)生影響，因為所有樣品還會作為篩選檢測的高濃度陽性樣品進(jìn)行測定。因此，結(jié)果明確表明，ELISA檢測適合用于篩選，包括未知牛奶樣品中三聚氰胺的檢測。 

根據(jù)前述結(jié)果，兩種測試都能用于準(zhǔn)確測定乳制品中三聚氰胺的殘留量。測試的靈敏度與質(zhì)譜分析的靈敏度相當(dāng)。不過，與色譜方法相比，ELISAs具有成本方面的優(yōu)勢。這種簡便、高通量的篩選方法能夠以較低的儀器成本、適中的運行價格，對上千個樣品進(jìn)行大規(guī)模的篩選。 

雖然這些方法對牛奶樣品中高濃度三聚氰胺的測定值稍低，但是其靈敏度達(dá)到的水平依然適合對三聚氰胺進(jìn)行篩選，作出有/無的判斷。當(dāng)這些方法用于篩選時，陽性樣品隨后仍然需要使用LC/MS/MS 或 GC/MS/MS方法確定三聚氰胺的確切含量。 

這種快速（總的檢測時間：大約1小時）并且具備成本效益的方法可以檢測牛奶中三聚氰胺的殘留量，從而對乳制品進(jìn)行高效的篩選，這確保了任何污染物都能被快速、簡便地發(fā)現(xiàn)。