對(duì)于很多工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程來(lái)說(shuō)，pH參數(shù)的監(jiān)測(cè)和控制是生產(chǎn)工藝的關(guān)鍵步驟，但pH參數(shù)的控制在生物制藥過(guò)程中更加重要，不可或缺�？刂坪眉�(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的pH參數(shù)是優(yōu)化生物制藥過(guò)程的參數(shù)及確保目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量和收率的關(guān)鍵。
但是不管是在生產(chǎn)的上游還是下游，控制的難點(diǎn)是：對(duì)pH參數(shù)很難準(zhǔn)確的進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。因?yàn)槲⑸�物在新陳代謝的同時(shí)也在改變著其所處環(huán)境的pH值，同時(shí)也在影響著其生長(zhǎng)過(guò)程的條件。此外，電極被污染或者在清潔消毒后不能進(jìn)行正確的校準(zhǔn)等情形都會(huì)造成pH測(cè)量值產(chǎn)生漂移從而影響讀數(shù)的準(zhǔn)確性。本文將討論這些因素，以及為什么pH控制對(duì)于生物制藥過(guò)程如此重要；并總結(jié)出一些實(shí)現(xiàn)pH控制的最佳實(shí)踐；最后簡(jiǎn)單的論述如何控制pH才能符合生物制劑藥品“質(zhì)量源于設(shè)計(jì)”的要求。
在生物制藥的下游工藝中，pH值(伴隨一定的離子濃度) 是色譜分析法中緩沖流動(dòng)相的一個(gè)關(guān)鍵特性，其對(duì)蛋白質(zhì)的提純起著決定性的作用。流動(dòng)相和靜止相之間的相互作用能影響色譜分析的功能，從而影響目標(biāo)產(chǎn)品和雜質(zhì)的分離。例如，在生產(chǎn)規(guī)模的生物加工過(guò)程中，產(chǎn)品提取、純度和產(chǎn)量等指標(biāo)受到生產(chǎn)培養(yǎng)過(guò)程中的緩沖液的制備和關(guān)鍵參數(shù)（比如pH）變化的影響，從而可能帶來(lái)負(fù)面的影響結(jié)果。
因此，從配料到完成操作的工藝實(shí)施階段過(guò)程中，自始至終必須嚴(yán)格的監(jiān)測(cè)pH值。
典型的上游應(yīng)用包括任何一個(gè)發(fā)酵過(guò)程的研發(fā)，優(yōu)化和實(shí)施，即利用活的微生物例如酵母、細(xì)菌或者真菌發(fā)酵生產(chǎn)活性藥物產(chǎn)品——或者利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，即利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)培養(yǎng)具有生物活性成分的藥物制品。
微生物的發(fā)酵周期（一般2-7天）通常比動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)的周期更短一些（動(dòng)物細(xì)胞通常為2周一批）。對(duì)于作為診斷和治療用的蛋白質(zhì)、病毒疫苗、體細(xì)胞和基因療法來(lái)說(shuō)，細(xì)胞外的pH值是一個(gè)極重要的過(guò)程參數(shù)。它必須跟其他參數(shù)比如媒介濃度和氧含量一樣，通過(guò)實(shí)施優(yōu)化控制來(lái)獲得我們想要的產(chǎn)品特性。必須對(duì)細(xì)胞外的pH值進(jìn)行有效的控制，才能確保細(xì)胞產(chǎn)品或者其衍生物的培養(yǎng)結(jié)果的高質(zhì)量和連續(xù)性。
pH值控制是極富有挑戰(zhàn)性的，因?yàn)橛袡C(jī)物的新陳代謝會(huì)改變其周圍環(huán)境的pH值。通常來(lái)說(shuō)，影響pH的典型因素主要包括以下幾個(gè)方面：
*碳水化合物在發(fā)酵結(jié)束后產(chǎn)生的有機(jī)酸（乳酸、乙酸、丁酸等）；
*含氮化合物，包括氨基酸生成的氨，尤其是當(dāng)介質(zhì)成分中氮:碳的比例高于1:4時(shí)，pH值易升高；
*培養(yǎng)介質(zhì)中二氧化碳的產(chǎn)生和碳酸的增加；
*有機(jī)酸（如琥珀酸）的陰離子的消耗會(huì)提高pH值。
因此在實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)生產(chǎn)工藝中對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)的pH值的管理和控制是一個(gè)重要的環(huán)節(jié)。通過(guò)許多研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)以及合適的培養(yǎng)介質(zhì)的開發(fā)有賴于連續(xù)完善的pH控制、適當(dāng)?shù)膮��?shù)微調(diào)或保持pH值不變。
培養(yǎng)基控制
大部分細(xì)胞培養(yǎng)基包含有可提供pH緩沖的成分，這是非常理想的，因?yàn)樵S多細(xì)胞的生長(zhǎng)受很窄的pH范圍的限制。通常使用酸（例如二氧化碳）和堿（例如碳酸鈉）來(lái)使pH保持在設(shè)定值的± 0.03pH范圍內(nèi)。
在對(duì)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)培養(yǎng)中的pH值進(jìn)行測(cè)量時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)早期細(xì)胞密度低時(shí)，pH的變化可以忽略不計(jì)，當(dāng)培養(yǎng)進(jìn)行至大約60小時(shí)左右時(shí)，pH開始迅速下降，然后穩(wěn)定不再變化。
培養(yǎng)基的pH值可以影響細(xì)胞的功能和性質(zhì)，包括：細(xì)胞繁殖，細(xì)胞分化，新陳代謝，細(xì)胞內(nèi)的pH，氨對(duì)細(xì)胞的影響，蛋白質(zhì)糖基化，蛋白質(zhì)合成，抗體生成，核糖核酸（RNA）酶的含量，酶的分泌、谷氨鹽的合成和分解。綜上所述，在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)過(guò)程中，pH控制非常有必要。
最近的一項(xiàng)研究表明，在無(wú)蛋白質(zhì)的培養(yǎng)介質(zhì)中，對(duì)典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞（包括白鼠骨髓瘤，NSO和 CHO）進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)pH在7.0到7.3之間時(shí)，培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量和產(chǎn)出率都比較高。結(jié)論表明上下0.3 pH的變化范圍可以成倍的影響細(xì)胞的產(chǎn)率。此外，當(dāng)細(xì)胞在正常的培養(yǎng)條件下，降低pH值能減少葡萄糖的利用率和乳酸的積聚率。
一個(gè)較低的特定的葡萄糖利用率被認(rèn)為是有益的，因?yàn)樗�可以減少一部分培養(yǎng)基中葡萄糖的數(shù)量，還可以簡(jiǎn)化飼料配方和添加方法，而較低的特定的乳酸積聚速率也同時(shí)降低了整體環(huán)境中的乳酸濃度，從而在控制pH值方面降低了中和用的堿性物質(zhì)需求，從系統(tǒng)上簡(jiǎn)化了過(guò)程操作，并改進(jìn)了過(guò)程的魯棒性。
在細(xì)胞表達(dá)水平方面的影響
生化生產(chǎn)上遇到的另一個(gè)挑戰(zhàn)是，每個(gè)個(gè)體的細(xì)胞株需要優(yōu)化自己特有的最佳允許范圍，因?yàn)樵诓煌�的�?xì)胞株之間也存在著顯著的差異。所以雖然絕大多數(shù)的生物反應(yīng)器都是利用CHO細(xì)胞，但仍然需要對(duì)pH值進(jìn)行優(yōu)化。
有些研究也關(guān)注pH值對(duì)關(guān)鍵細(xì)胞的表面蛋白質(zhì)的表達(dá)水平方面產(chǎn)生的影響，重要的是那些細(xì)胞的表面蛋白質(zhì)參與了關(guān)鍵功能的調(diào)解，如病毒的傳染，癌癥細(xì)胞的識(shí)別等。有實(shí)驗(yàn)證明：細(xì)胞外pH值的變化也可能改變某些細(xì)胞表面受體的表達(dá)水平。同時(shí)，降低細(xì)胞外的pH值會(huì)導(dǎo)致HL60細(xì)胞內(nèi)CD13的表達(dá)增加，而對(duì)CD13的mRNA的水平?jīng)]有影響。這表明細(xì)胞外的pH值在蛋白質(zhì)合成或蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞表面方面是有影響的。此外，細(xì)胞外pH值的降低也深刻影響著細(xì)胞的新陳代謝。細(xì)胞培養(yǎng)在pH值7.0和7.2時(shí)表現(xiàn)出的葡萄糖消耗和乳酸生產(chǎn)率比培養(yǎng)基pH值為7.4時(shí)要降低20%-40%。
降低培養(yǎng)基的pH值會(huì)降低葡萄糖消耗和乳酸生產(chǎn)速度，這一趨勢(shì)也被對(duì)HeLa（人子宮頸癌傳代細(xì)胞）細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞所做的實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)：隨著培養(yǎng)基的pH值從7.6降到6.8，雜交瘤細(xì)胞表現(xiàn)出生長(zhǎng)率降低，以及葡萄糖消耗和乳酸生產(chǎn)率降低。另一個(gè)對(duì)比實(shí)驗(yàn)是通過(guò)觀察HL60細(xì)胞的培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)基的pH值從7.4降到7.0時(shí)，HL60生長(zhǎng)率基本上未受影響，但是觀察也發(fā)現(xiàn)葡萄糖消耗和乳酸生產(chǎn)速度降低了20-40%。
總體收益率更好的原因可能是在pH值較低情況下，細(xì)胞對(duì)其他營(yíng)養(yǎng)素的利用率更高，從而降低了代謝能量的需求(包括細(xì)胞修復(fù))，或者更有可能的是，復(fù)雜的事件可能會(huì)涉及幾個(gè)代謝和膜過(guò)程。
顯然，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)，pH值是一個(gè)重要的生物工藝參數(shù)，因?yàn)樗鼤?huì)影響細(xì)胞生理學(xué)，蛋白質(zhì)表達(dá)與品質(zhì)，細(xì)胞分化等許多方面。
糖基化產(chǎn)品
蛋白質(zhì)的糖基化在蛋白質(zhì)治療藥物的有效性方面是至關(guān)重要的。帶有N-乙�；�神經(jīng)氨酸(又名唾液酸)的N-聯(lián)-糖基化蛋白治療藥物，是一個(gè)用于產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)估的典型標(biāo)記物，其中N-乙�；�神經(jīng)氨酸(又名唾液酸)可改善藥物的循環(huán)半衰期。目前市場(chǎng)上的糖基化產(chǎn)品包括許多重磅炸彈類藥物，如：Avastin、Enbrel、Erbitux和Herceptin等等。對(duì)于監(jiān)管者來(lái)說(shuō)在生產(chǎn)中獲得穩(wěn)定一致的糖型結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。完整描述一個(gè)分子治療藥物的通常做法是結(jié)合使用酶法、液相色譜分析法和質(zhì)譜法來(lái)徹底描述其碳水化合物結(jié)構(gòu)。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)，特別是CHO細(xì)胞，是生產(chǎn)商業(yè)用糖基化蛋白的首選方法。因?yàn)樗麄兪且环N天生的加工機(jī)器，包括蛋白質(zhì)的糖基化，而且非常類似于人類的細(xì)胞。然而，細(xì)胞類型、培養(yǎng)過(guò)程和媒介等因素對(duì)糖基化結(jié)構(gòu)具有關(guān)鍵性的影響。大多數(shù)的影響作用是通過(guò)影響發(fā)生在宿主細(xì)胞內(nèi)的代謝過(guò)程，這些代謝過(guò)程pH值極度相關(guān)。例如，作為谷氨酰胺和天冬酰胺代謝的副產(chǎn)品，銨離子可以驅(qū)動(dòng)細(xì)胞內(nèi)pH值增加和降低末端唾液酸化作用，這一作用反過(guò)來(lái)可以極大地影響藥代動(dòng)力學(xué)和功效。
經(jīng)發(fā)現(xiàn)生物反應(yīng)器中的pH值也會(huì)影響蛋白糖基化。例如，在雜交瘤細(xì)胞內(nèi)，pH值變化對(duì)單克隆抗體的半乳糖基化和唾液酸化作用都有影響。pH值增加到7.4及以上，似乎可以促進(jìn)在HEPES緩沖培養(yǎng)基中半乳糖復(fù)式聚糖的生長(zhǎng)，而pH值降低則促進(jìn)形成單一或乳糖復(fù)式聚糖。
通過(guò)降低培養(yǎng)基的pH到最優(yōu)的pH值區(qū)間6.8- 7.2，可以促進(jìn)紅細(xì)胞生成素中酸性亞型比例的增加，順利實(shí)現(xiàn)唾液酸化的作用。不過(guò)需要注意的是，有時(shí)pH值的影響并不總是向著一個(gè)方向變化的，在CHO細(xì)胞表面，如果存在一個(gè)更高的pH值，則對(duì)多唾液酸附加到神經(jīng)細(xì)胞粘附分子的表達(dá)可能會(huì)有相反的效果。
干細(xì)胞培養(yǎng)
隨著干細(xì)胞作為潛在治療藥物的重要性日益提高，人們對(duì)于了解和優(yōu)化干細(xì)胞加工的興趣更加濃厚。幾乎所有的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)都是在理想的標(biāo)準(zhǔn)條件下(pH值為7.4，20%的氧氣，5%二氧化碳，37°C)，但不同的細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)于干細(xì)胞的繁殖和分化有著不同的最佳狀態(tài)。例如，更高的pH值(pH值7.6)被發(fā)現(xiàn)可以提高巨核細(xì)胞的干細(xì)胞分裂和成熟，同時(shí)也有利于紅細(xì)胞的分化。但相反，對(duì)于粒細(xì)胞生成來(lái)說(shuō)，在低pH(pH值為7.21)下更佳，因?yàn)榈蚿H能夠提高粒細(xì)胞集落刺激因子受體(G-CSFR)的表達(dá)和粒細(xì)胞的增殖和分化。
除非是對(duì)pH進(jìn)行正確的控制，否則細(xì)胞質(zhì)量和/或一致性方面的問(wèn)題將可能會(huì)非常多。但是有效的pH值控制并不一定總能很容易實(shí)現(xiàn)，因?yàn)閜H的變化會(huì)造成細(xì)胞培養(yǎng)基空間的非均勻性。此外，細(xì)胞外的pH值可能隨著培養(yǎng)基的不同而變化劇烈，尤其在細(xì)胞密度增加時(shí)。最近的研究顯示，T型玻璃瓶中的中國(guó)倉(cāng)鼠纖維母細(xì)胞，在6小時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，盡管大環(huán)境的pH值保持在7.6，但其局部環(huán)境的pH值有時(shí)仍可能為6.5。顯然，在生物反應(yīng)容器中需要使用溫和的攪拌來(lái)提供出更均勻的細(xì)胞外同質(zhì)性環(huán)境。
研究人員通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在一個(gè)中空纖維反應(yīng)器系統(tǒng)中存在養(yǎng)分濃度梯度，這種現(xiàn)象可能最終會(huì)形成整體環(huán)境的pH值梯度和溶解氧梯度。研究表明，不同培養(yǎng)基的pH值對(duì)細(xì)胞的功能和屬性存在不同的影響。
蛋白質(zhì)聚集
實(shí)現(xiàn)精確的pH值控制也可以幫助減少在生物制藥生產(chǎn)中常見的蛋白質(zhì)聚集現(xiàn)象。蛋白質(zhì)聚集可能會(huì)表現(xiàn)為許多形式。例如，可逆蛋白質(zhì)聚集就是相對(duì)較弱的共價(jià)蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)果，這種相互作用不斷的調(diào)整單體和高階形式兩者之間的平衡。這種平衡很容易被細(xì)胞外的一個(gè)簡(jiǎn)單的pH值的改變而打破。
傳感器功能和數(shù)據(jù)漂移
在生物加工時(shí)對(duì)pH值進(jìn)行測(cè)量的另一個(gè)挑戰(zhàn)是清洗過(guò)程。一個(gè)發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器在開始下一個(gè)生產(chǎn)過(guò)程前必須經(jīng)過(guò)清洗和消毒處理，以確保不會(huì)發(fā)生批次交叉污染或有害的微生物污染。此外，由于pH值傳感器的校準(zhǔn)方法需要使用緩沖液進(jìn)行兩點(diǎn)校準(zhǔn)。但是傳感器上殘余的緩沖液化學(xué)品必須在批生產(chǎn)前除去。原位清洗 (CIP)應(yīng)該先于原位蒸汽消毒(SIP)步驟。尤其注意的是在高溫蒸汽消毒時(shí)，由于暴露于高溫蒸汽中并經(jīng)受劇烈的熱沖擊，pH傳感器功能會(huì)受到顯著的影響。
不同的培養(yǎng)批次有不同的最佳控制設(shè)定值，在同一批次的不同培養(yǎng)階段pH值也可能會(huì)改變。使用經(jīng)典的玻璃pH電極時(shí)，存在許多因素可能導(dǎo)致pH測(cè)量值發(fā)生漂移，從而減弱測(cè)量值的可信度。這些影響因素包括電極被污染或參比電極結(jié)垢鈍化。
一個(gè)安裝在反應(yīng)器上的pH傳感器經(jīng)過(guò)消毒之后就不能再進(jìn)行兩點(diǎn)緩沖液校準(zhǔn)了，因?yàn)殡姌O不能被重新拿出來(lái)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)緩沖液校準(zhǔn)。因此，最終的結(jié)果是執(zhí)行更頻繁的離線pH測(cè)試，然后整理出在線測(cè)量和離線測(cè)量的對(duì)應(yīng)關(guān)系，并使之標(biāo)準(zhǔn)化(即：一點(diǎn)校準(zhǔn))。這種校準(zhǔn)方法使用在更長(zhǎng)的生產(chǎn)批次時(shí)更為必要，當(dāng)然這需要訓(xùn)練有素的人員在現(xiàn)場(chǎng)去正確執(zhí)行這一任務(wù)。
一旦一個(gè)有治療作用的蛋白質(zhì)從一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)載體(或其它表達(dá)系統(tǒng))生產(chǎn)出來(lái)，它必須被進(jìn)一步提純，以減少或消除宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、病毒和生產(chǎn)過(guò)程中可能產(chǎn)生的相關(guān)雜質(zhì)。為了提純和濃縮所需的蛋白質(zhì)，可使用正交提純技術(shù)，這種技術(shù)利用分子之間存在的親合力、電荷、大小或其他屬性方面的差異，將需要的成分和不希望的成分區(qū)分開來(lái)。
在這個(gè)過(guò)程中，蛋白質(zhì)將經(jīng)歷一個(gè)pH值、離子強(qiáng)度和濃度的大范圍改變。以上這些都是至關(guān)重要的，因此必須密切控制目標(biāo)蛋白質(zhì)以防止其在生產(chǎn)過(guò)程中流失（如蛋白質(zhì)的聚集）。
符合QbD原則
按照質(zhì)量來(lái)源于設(shè)計(jì)(QbD)的原則，實(shí)施過(guò)程分析技術(shù)(PAT)來(lái)促進(jìn)生物制藥過(guò)程是至關(guān)重要的。過(guò)程分析技術(shù)(PAT)可以保證那些要求嚴(yán)格的過(guò)程環(huán)境參數(shù)的一致性，如pH值等。在過(guò)去的10年里，許多蛋白表達(dá)的效價(jià)增加了1000倍達(dá)到g/L的范圍。因此其下游的生物工藝，包括緩沖液準(zhǔn)備和交付等不得不進(jìn)行相應(yīng)比例的增加以便保持與之同步增長(zhǎng)。同樣的，隨著更先進(jìn)的技術(shù)和工藝的出現(xiàn)，大量的高精度工業(yè)級(jí)生物反應(yīng)器的生產(chǎn)和提供，對(duì)于反應(yīng)器培養(yǎng)過(guò)程中的關(guān)鍵性參數(shù)如pH值的反饋控制等就變得更加重要。
在蛋白質(zhì)的純化和分離過(guò)程中，離子交換柱的利用是一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。離子交換柱分離蛋白質(zhì)的功能是利用蛋白質(zhì)在一個(gè)特定的pH值條件下的凈表面電荷，基于帶電的蛋白質(zhì)和一個(gè)帶相反電荷的層析介質(zhì)之間可逆的相互作用。以下幾點(diǎn)需要重點(diǎn)考慮:
*蛋白質(zhì)具有0凈電荷：pI = pH值 不會(huì)與帶電介質(zhì)結(jié)合；
*蛋白質(zhì)pI < pH值 將與一個(gè)帶正電的介質(zhì)或陰離子交換劑結(jié)合；
*蛋白質(zhì)pI > pH值 將與一個(gè)帶負(fù)電的介質(zhì)或陽(yáng)離子交換劑結(jié)合。
使用一個(gè)連續(xù)或逐步的鹽梯度或者pH梯度可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行洗脫。pH值梯度分離需要1-2個(gè)單位的pH值改變以分隔兩種帶不同電荷的蛋白質(zhì)。酸和堿之間的滴定曲線，無(wú)論是強(qiáng)還是弱，都不是線性的。因此在層析法中具有類似pI的蛋白質(zhì)的分離時(shí)避免采用pH梯度。
通常的，弱酸（如醋酸）和弱堿（如氫氧化銨）混合時(shí)，當(dāng)使用質(zhì)量流量時(shí)混合的結(jié)果表現(xiàn)為s形滴定曲線陡峭的上升，在非常短的時(shí)間內(nèi)pH值從6.5升到pH值9。然而，經(jīng)過(guò)證實(shí)，當(dāng)使用一個(gè)基于PAT的包含有精確地加酸調(diào)節(jié)的反饋控制系統(tǒng)時(shí)，可以生成一個(gè)線性的pH值梯度，這樣的話就能促進(jìn)更高效的層析分離。
總之，pH值的測(cè)量在生物制藥生產(chǎn)的所有方面都扮演著重要角色。在cGMP強(qiáng)制性條款的要求下，精確的pH控制是保證生產(chǎn)保持高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的必要條件。一次性生產(chǎn)技術(shù)的引入為pH傳感器制造商帶來(lái)了一個(gè)新的挑戰(zhàn)。新技術(shù)的推出正緊跟行業(yè)快速發(fā)展的需求。